組胺含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5675

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入65μL蒸餾水溶解，2-8℃可保存4周。

2. 試劑二工作液的配制：根據(jù)樣本量按照試劑二：試劑二稀釋液=10μL：300μL（共310μL，約10S）的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)液。

4. 0.1875μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：取75μL10μmol/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)液，加入925mL蒸餾水，混勻配制成0.75μmol/mL的組胺標(biāo)準(zhǔn)品；再吸取250μL 0.75μmol/mL組胺和750 μL蒸餾水混合配制成0.1875μmol/mL的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

組胺（Histamine）是一種有潛在危害的含氮低分子量有機(jī)化合物，是由組*酸在脫羧酶的作用下產(chǎn)生的。當(dāng)組織受到損傷或發(fā)生炎癥和過(guò)敏反應(yīng)時(shí)，都可釋放組胺。組胺廣泛存在于各種食品中，攝入過(guò)量的組胺會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。組胺會(huì)被組胺脫氫酶（HDH）特異性分解，在1-mPMS作用下，電子轉(zhuǎn)移通過(guò)WST顯色，在470nm下有最大吸收峰，據(jù)此可以計(jì)算組胺含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、勻漿器/研缽、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）為1：2.5~5的比例（建議稱(chēng)取約0.2g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后，于60℃水浴30min，冷卻至室溫后于4℃ 10000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測(cè)。

2. 紅酒等（酚類(lèi)含量高）液體：稱(chēng)取粉劑一0.05g，加入500μL液體樣本和500μL提取液一，冰浴勻漿后，于60℃水浴30min，冷卻至室溫后于4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測(cè)。

注：1、提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

2、樣本提取后盡可能在2小時(shí)內(nèi)測(cè)定結(jié)束，若樣本量過(guò)多建議分批次處理。

3、含酚類(lèi)高的樣本，前處理時(shí)加入粉劑一約0.05g，與樣本一起冰浴勻漿。如紅酒，前處理時(shí)取500μL液體樣本加入500μL提取液一，和粉劑一約0.05g（無(wú)需準(zhǔn)確稱(chēng)量），之后按照液體樣本繼續(xù)進(jìn)行冰浴勻漿后等后續(xù)處理。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至470nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一37℃預(yù)熱15min。

3、 操作表：（在1.5mL EP管或96孔板中依次加入以下試劑）

三、組胺含量的計(jì)算

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

組胺含量（μmol/mg prot）=ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F

=0.1875×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×Cpr×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1875μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.03mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測(cè)定；F：稀釋倍數(shù)。

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

組胺含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×F =0.223×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1875μmol/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；F：稀釋倍數(shù)。

3. 按照液體體積計(jì)算

組胺含量（μmol/mL）

=ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）] ×F

=0.445×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1875μmol/mL；V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，0.5mL；V液體：液體樣本體積，0.5mL；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。如需測(cè)定蛋白含量，需另取組織。

2. 如果樣本測(cè)定吸光值小于0.05或接近空白管吸光值，可適當(dāng)增大樣本量，空白管和標(biāo)準(zhǔn)管也需要進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

3. ΔA測(cè)定大于1或者A測(cè)定大于1.5時(shí)，可用整理水稀釋樣本進(jìn)行測(cè)定。

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