1-吡咯啉-５-羧酸合成酶（P5CS）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC4425

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、試劑三：臨用前取1支加入0.833 mL蒸餾水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。-20℃分裝保存；-20℃保存一周；

2、試劑四：臨用前加入3 mL蒸餾水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。-20℃分裝保存；-20℃保存一周。

產(chǎn)品說明：

在干旱、鹽漬化、重金屬、紫外線等不同的脅迫條件下，均會誘導植物體內(nèi)脯*酸的積累，對植物起到保護作用。高等植物中，脯*的合成有兩條途徑，分別以谷/酸和鳥*酸為前體。谷/酸途徑主要負責脅迫條件下脯*酸的積累，而鳥*酸途徑主要在氮充足條件下起作用，與脅迫情況下脯*酸的積累沒有關系。

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯*酸的谷/酸合成途徑中的關鍵酶，P5CS是一個雙功能酶，在NADPH和ATP作用下，可催化谷/酸磷酸化及/氨酸 γ-半醛還原，通過測定NADPH在340 nm處吸光度的變化，可計算出P5CS的活性高低。

Glutamate+Glutamate Gamma-Semialdehyde+NADPH(340nm)+ ATP             Compound

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織樣本：按質(zhì)量（g）︰提取液體積（mL）1︰5~10比例（建議稱取0.1 g樣本，加入1.0 mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后加入10 μL提取液二，于4℃，8000 rpm，離心15 min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至340 nm，蒸餾水調(diào)零。  

2、 將試劑三、試劑四置于冰上待測。

3、 操作表：（在微量石英比色皿/96孔UV板中操作）

注意：空白管只需測定1-2次。

三、P5CS酶活計算

1、按樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADPH為一個酶活單位。

P5CS酶活（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T =321.54×ΔA÷Cpr÷d

2、按樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol NADPH為一個酶活單位。

P5CS酶活（U/g 質(zhì)量）= ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T =324.76×ΔA÷W÷d

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：微量比色皿光徑，1 cm/96孔UV板光徑，0.6 cm；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1.01 mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，5 min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項：

1、當A1測定高于1.5或者ΔA大于0.5時，建議將樣本稀釋后檢測，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2、盡量使用新鮮樣本進行檢測，操作時請置于冰上操作。

3、ΔA空白管的數(shù)值一般不超過0.05。

實驗實例：

1、取0.1g三葉草進行樣本處理，樣本稀釋2倍，按照測定步驟操作（微量石英比色皿檢測），計算得ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.0302-0.9842=0.046，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.7431-0.7248=0.0183，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.0277，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：

P5CS酶活（U/g 質(zhì)量）=324.76×ΔA÷W=179.9U/g 質(zhì)量。

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