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當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章瓊脂糖凝膠電泳常見問題

瓊脂糖凝膠電泳常見問題

更新時(shí)間:2016-05-04點(diǎn)擊次數(shù):3710

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對(duì)于分子量較大的樣品,如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳常見為題都有哪些?、

一、DNA帶模糊、

1、DNA降解:瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)中要避免核酸酶污染

2、電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多系使用后,離子強(qiáng)度降解,PH值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳實(shí)驗(yàn),建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。

3、所用電泳條件不合適:電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/cm,溫度<30℃;巨大DNA鏈電泳,溫度應(yīng)該<15℃;檢車所有電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力

4、DNA上揚(yáng)量過多:應(yīng)減少凝膠中DNA上樣量。

5、DNA樣含鹽量過高:電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。

有蛋白污染:電泳前酚抽提去除蛋白

二、不規(guī)則DNA帶遷移

1、對(duì)于λ/HindⅢ片段cos位點(diǎn)復(fù)性:電泳前于65℃加熱DNA5分鐘,然后在冰上冷卻5分鐘。

2、電泳條件不合適:電泳電壓不超過20V/cm;溫度<30℃;經(jīng)常更換電泳緩沖液。

3、DNA變性:以20mM NaCI Buffer稀釋DNA,電泳前勿加熱。

三、帶弱或無DNA帶

1、DNA的上樣量不夠:增加DNA的上樣量;聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳靈敏度稍高,上樣量可適當(dāng)降低。

2、DNA降解:避免DAN的核酸酶污染

3、DNA走出凝膠:縮短電泳時(shí)間,降低電壓,增強(qiáng)凝膠濃度。

4、對(duì)于EB染色的DNA,所用光源不合適:應(yīng)用短波長(254mm)的紫外光源

四、DNA帶缺失

1、小DNA帶走出凝膠:縮短電泳時(shí)間,降低電壓,增強(qiáng)凝膠濃度。

2、分子大小相近的DNA帶不易分辨:增加電泳時(shí)間,核準(zhǔn)正確的凝膠濃度。

3、DNA變性:電泳前請(qǐng)勿高溫加熱NDA鏈,以20mM NacI Buffer稀釋DNA

4、DNA鏈巨大,常規(guī)凝膠電泳不合適:在脈沖凝膠電泳上分析。

綜上所述,瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)需注意以下幾點(diǎn):

1.體系配制時(shí)候關(guān)鍵的幾個(gè)試劑一定要確定它們還有效、或者還沒被污染:引物,酶,超純水。這些東西好自己收好,寫上個(gè)人的名字放好,冰盒上記得帶上橡皮筋,這樣就不會(huì)因?yàn)閯e人翻冰箱時(shí)候把你的冰盒碰散了,試劑都碰掉。否則,你的試劑被污染了,到時(shí)候陰性對(duì)照狂出條帶,再去找污染源很麻煩。而且配置體系時(shí)候要注意保持實(shí)驗(yàn)區(qū)的干凈,事先可用小噴壺進(jìn)行酒精噴霧,固定空氣中的DNA,而且全程要戴手套,避免污染體系。

2.pcr體系要摸準(zhǔn),好用人家都做得很多的老體系來上手。

3.要想得到漂亮的電泳圖,可以在PCR開始時(shí)候就把膠倒上(前提是你的PCR總時(shí)間在1.5小時(shí)左右,并且1.5小時(shí)候之后你還在實(shí)驗(yàn)室。),讓凝膠涼著,這樣凝膠的上樣孔會(huì)比較規(guī)則,膠體里面的其本身的孔徑也會(huì)較規(guī)則。如果你要第二天再跑膠,千萬記得把PCR完畢的樣本放4℃保存。第二天做時(shí)候建議把膠涼上25分鐘左右。

4.瓊脂糖凝膠電泳上樣時(shí)候建議使用排槍上樣,不僅快速而且樣本加到膠孔里的速度一致。當(dāng)然,排槍上樣好選用進(jìn)口吸頭,國產(chǎn)槍頭就不要想了。

5.不管電泳室使用的頻率高還是低,我都建議每次瓊脂糖凝膠電泳時(shí)候更換電泳液,避免出現(xiàn)“^”形條帶。

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