穩(wěn)定同位素標記物是研究代謝的有力工具，越來越多地用于體內(nèi)代謝研究，穩(wěn)定同位素標記物在體內(nèi)代謝研究中已經(jīng)解決了許多生物學問題，如：代謝路徑的確認、疾病機理的探索、新調(diào)控原理的發(fā)現(xiàn)、新治療靶點及生物標志物的確認、新診斷方法的實施及個性化治等^[1]。

小分子穩(wěn)定同位素標記物是指利用穩(wěn)定同位素（如 2H、13C等）替代化合物中原有的常見同位素（如 1H、12C），從而被標記的、相對分子質(zhì)量較小的有機或無機化合物。這種同位素標記物核心特點是化學性質(zhì)與未標記的物質(zhì)幾乎保持一致和因質(zhì)量不同導致的物理性質(zhì)的差異，具有無放射性安全環(huán)保和可被質(zhì)譜等儀器檢測到的優(yōu)勢。

原理與用途

其基本原理基于以下兩個關鍵點：

化學性質(zhì)一致性原理

由于穩(wěn)定同位素（如 13C 和 12C）的電子層結構相同，因此由它們構成的標記物與其未標記的對應物具有幾乎相同的化學和生物化學行為。這意味著它們在色譜分離中的保留時間、在生化反應中的酶促反應速率、與受體的結合能力等都是相同的。

質(zhì)量差異的可檢測性

雖然化學性質(zhì)相同，但含有重同位素的分子比未標記的分子質(zhì)量更大。

這種質(zhì)量差異雖然很小，但可以被高精度的質(zhì)譜儀精確地區(qū)分和檢測。質(zhì)譜儀能夠根據(jù)質(zhì)荷比（m/z）將“輕"標分子和“重"標分子分離開，并分別對它們的信號強度進行定量。

圖1  13C-谷氨酰胺納入三氯胺酸循環(huán)^[2]

1. 代謝流分析

這是常用的應用之一。通過給細胞、組織或生物體喂食特定位置被標記的底物（例如，13C-葡萄糖），可以追蹤標記原子在代謝網(wǎng)絡（如糖酵解、三羧酸循環(huán)）中的流動路徑和速率?？梢杂糜谘芯看x途徑的活躍程度、發(fā)現(xiàn)新的代謝通路、在疾?。ㄈ绨┌Y）中代謝重編程的機制等。

2. 絕-對定量分析

在質(zhì)譜-based的定量分析中，將已知量的穩(wěn)定同位素標記（作為內(nèi)標）加入到含有未知量目標分析物的樣品中。由于穩(wěn)定同位素標記和分析物在樣品前處理（如萃取、衍生化）和色譜分離過程中的行為一致，但能被質(zhì)譜區(qū)分，因此可以通過穩(wěn)定同位素標記的回收率來精確校正分析物的損失。最終，通過比較兩者的質(zhì)譜信號強度，即可精確計算出分析物的絕-對量。

3. 藥物代謝動力學研究

在藥物開發(fā)中，使用穩(wěn)定同位素標記的藥物分子來研究ADME過程，藥物被身體吸收的程度、藥物在體內(nèi)的分布情況、藥物被代謝成哪些產(chǎn)物和藥物及其代謝物被排出的速度和途徑。使用穩(wěn)定同位素標記可以清晰地將給藥后的藥物分子與內(nèi)源性物質(zhì)或代謝產(chǎn)物區(qū)分開來，并進行精確定量。

4. 作為內(nèi)標

即使在非定量的篩查中，穩(wěn)定同位素標記也常被用作保留時間內(nèi)標或過程監(jiān)控內(nèi)標，以校正儀器響應的漂移和樣品制備過程中的變異，提高數(shù)據(jù)的可靠性和重復性。

穩(wěn)定同位素標記物——優(yōu)秀示蹤劑

常用的示蹤劑有穩(wěn)定和放射兩種同位素示蹤劑，穩(wěn)定同位素示蹤劑因其標記方式靈活多樣、示蹤時長不受半衰期限制、給藥方式多樣及示蹤通路研究較多等而受到體內(nèi)代謝研究實驗的追捧。

穩(wěn)定同位素示蹤劑應用較多的為含氘 (²H)、碳-13 (¹³C)、碳-15 (¹⁵N)、氧-18 (¹⁸O) 等的同位素標記物，全標記的示蹤劑具有作為全局示蹤劑的潛力目前廣泛用于代謝研究中，它們可以一次將標記轉移到多個下游途徑中，研究多個通量，如全 ¹³C 標記的葡萄糖 (D-Glucose-¹³C6) 和谷氨酰胺 (L-Glutamine-¹³C5) 等，通過給藥體內(nèi)，可分析下游代謝產(chǎn)物，找出上下游代謝途徑及其它們的內(nèi)在關系、代謝產(chǎn)物的組成和含量等，甚至研究細胞代謝的動態(tài)變化。

圖2  通過¹³C標記確認OxPPP 和 Non-OxPPP 代謝途徑^[3]

而特定位置標記的穩(wěn)定同位素示蹤劑因其在特定位置的同位素原子會轉移到特定的代謝物中，對研究特定通路方面具有明顯優(yōu)勢，目前也被廣泛應用于體內(nèi)代謝研究匯中，如有 [1-¹³C]-glucose 和 [1，2-¹³C]-glucose 在研究葡萄糖是參與的有氧化磷酸戊糖 (OxPPP) 還是非氧化磷酸戊糖 (Non-OxPPP) 途徑中發(fā)揮了重大作用[3]。

如何選擇合適穩(wěn)定同位素示蹤劑——體內(nèi)代謝

1、選定標記策略

測通量/速率 → 單一位置標記

例：測糖酵解通量，用 13C-1-葡萄糖。

探索未知途徑/全局視圖 → 均勻標記

例：探索葡萄糖的全面命運，用 13C6-葡萄糖。

區(qū)分相似分支途徑 → 位置特異性標記

例：TCA循環(huán)與回補反應，用 13C-1,2-葡萄糖。

2、選定標記原子

碳代謝（糖、脂、氨基酸） → 13C

脂質(zhì)合成/氧化還原 → 2H

蛋白質(zhì)/氨基酸代謝 → 1?N

能量代謝/ATP合成 → 1?O

3、選定合適給藥方式

口服：方便，模擬天然攝食。但需考慮首過效應和腸道微生物的干擾。

靜脈注射：可快速達到穩(wěn)定血藥濃度，提供清晰的動力學起點。

腹腔注射：折中方案，吸收較快且操作相對簡單。

輸注：用于穩(wěn)態(tài)代謝流分析，通過持續(xù)輸注使體內(nèi)示蹤劑達到“同位素穩(wěn)態(tài)"。

4、上機檢測

僅能測標記/未標記 → 低分辨率質(zhì)譜 → 選擇簡單標記。

能測同位素標記模式 → 高分辨率質(zhì)譜 → 可選擇均勻或位置特異性標記。

小提示

標記物性質(zhì)：要求穩(wěn)定（在體內(nèi)不分解、不交換）與惰性（不干擾正常代謝）。

代謝路徑：要求清晰可控，需預先明確其代謝途徑與產(chǎn)物，確保數(shù)據(jù)可解讀。

實驗操作：方案需具體可行，包括遞送方法、劑量、樣品處理與數(shù)據(jù)分析方法。

經(jīng)濟成本：預算需提前規(guī)劃，因標記物價格昂貴，需根據(jù)實驗規(guī)模權衡策略與總量。

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